畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)及發(fā)酵工藝

更新時(shí)間：2025-01-02 點(diǎn)擊次數(shù)：2807

一、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)作為一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域和顯著的優(yōu)勢(shì)。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)明顯。它擁有目前強(qiáng)、調(diào)控機(jī)理嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一 —— 醇氧化酶基因 AOX1 啟動(dòng)子，這使得外源基因的表達(dá)調(diào)控更加精準(zhǔn)高效。其表達(dá)水平高，既能實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)，又可進(jìn)行分泌型表達(dá)，極大地滿(mǎn)足了不同研究和生產(chǎn)的需求。發(fā)酵工藝成熟且易于放大，已經(jīng)具備大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的能力，為產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了便利條件。培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離，所用發(fā)酵培養(yǎng)基廉價(jià)，且不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品的分離純化，降低了生產(chǎn)成本。外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，整合到畢赤酵母染色體上后，能隨染色體復(fù)制而穩(wěn)定存在，不易丟失。此外，作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母還具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白進(jìn)行糖基化、脂肪?；⒌鞍琢姿峄确g后修飾加工，使表達(dá)出的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，具有更高的生物活性。

二、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)成

1、宿主菌

目前用于外源蛋白表達(dá)的畢赤酵母宿主菌有： Mut+甲醇利用型GS115、X-33、SMD1165、SMD1163及 SMD1168等大多宿主菌；MutS甲醇利用緩慢型KM71； Mut-甲醇不利用型MC100-3。詳見(jiàn)下表，詳細(xì)地列舉了畢赤酵母不同的表達(dá)宿主菌及表達(dá)特點(diǎn)

表 1常見(jiàn)的畢赤酵母表達(dá)宿主菌及特點(diǎn)

菌株	特點(diǎn)
GS115	具有高表達(dá)水平、高細(xì)胞密度、高可溶性蛋白產(chǎn)量，目前應(yīng)用廣的宿主菌
KM71	甲醇利用緩慢型，適用于表達(dá)難以溶解的蛋白質(zhì)
X33	可使表達(dá)量和活性提高，適用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)
SMD1168H	更好的表達(dá)效率和更高的細(xì)胞密度，適用于表達(dá)大分子蛋白質(zhì)
SMD116（his4 pep4）	屬于蛋白酶缺失型菌株，能夠減少蛋白降解，解決由于蛋白降解而引起的表達(dá)產(chǎn)物分布不均的問(wèn)題，不過(guò)該菌株生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，可能導(dǎo)致表達(dá)的外源蛋白質(zhì)產(chǎn)量較低。
Y-11430	高效的表達(dá)能力并且具有可調(diào)控的表達(dá)

2、載體

畢赤酵母表達(dá)載體以整合型載體為主，常見(jiàn)載體可分為胞內(nèi)表達(dá)載體和分泌表達(dá)載體。

表 2 常見(jiàn)的畢赤酵母表達(dá)宿載體及特點(diǎn)

胞內(nèi)表達(dá)載體	特點(diǎn)
pPIC3.5K	基于 AOX1 啟動(dòng)子的胞內(nèi)表達(dá)載體，可以進(jìn)行高水平的胞內(nèi)表達(dá)
pPIC3K	基于 AOX1 啟動(dòng)子的胞內(nèi)表達(dá)載體，可以在畢赤酵母中表達(dá)目的蛋白，并帶有 kanamycin 抗性標(biāo)記
pGAPZ	基于 GAPDH 啟動(dòng)子的胞內(nèi)表達(dá)載體，適用于表達(dá)中等至高水平的目的蛋白質(zhì)，并可進(jìn)行分泌或胞內(nèi)表達(dá)
pGAPZα	與 pGAPZ 類(lèi)似，但帶有 α 因子信號(hào)序列，可提高表達(dá)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和產(chǎn)量
胞外表達(dá)載體	特點(diǎn)
pPICZαA/B/C	基于 AOX1 啟動(dòng)子的胞外表達(dá)載體，可以在畢赤酵母中表達(dá)目的蛋白，并具有 α 因子信號(hào)序列，可進(jìn)行高效的分泌表達(dá)
pPIC9K	基于 AOX1 啟動(dòng)子的胞外表達(dá)載體，可用于高水平的胞外表達(dá)，并帶有 G418 抗性標(biāo)記
pPIC3.5K-BGH	基于 AOX1 啟動(dòng)子的胞外表達(dá)載體，帶有 β 半乳糖苷酶信號(hào)序列，可用于檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)和分泌
pYAM75P	含有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，方便進(jìn)行重組操作

三、畢赤酵母發(fā)酵工藝

1、畢赤酵母發(fā)酵階段

畢赤酵母的發(fā)酵一般分兩個(gè)階段：1、細(xì)胞增長(zhǎng)階段：首先在碳源為甘油或葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行的生長(zhǎng)階段，積累足夠的細(xì)胞密度和生物量，在菌體濃度達(dá)到一定階段時(shí)，當(dāng)甘油或葡萄糖耗盡時(shí)，會(huì)導(dǎo)致溶解氧值突然上升至100%左右，然后開(kāi)始流加甘油或葡萄糖溶液，并保持通風(fēng)量和攪拌速度，以維持溶解氧水平在30%左右，進(jìn)一步增長(zhǎng)生物量（菌濃）。2、誘導(dǎo)階段：當(dāng)生物量達(dá)到要求后，停止補(bǔ)碳源，碳源耗盡，過(guò)渡期結(jié)束后，將碳源切換至甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)蛋白的發(fā)酵階段。一般間歇加入0.3%甲醇兩次誘導(dǎo)，然后開(kāi)始流甲甲醇誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，這種方式可以提高外源蛋白的表達(dá)水平，并且使得畢赤酵母在較短時(shí)間內(nèi)積累高濃度的目標(biāo)蛋白。

誘導(dǎo)表達(dá)階段是畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在此階段，甲醇被用作特異性誘導(dǎo)劑，替代先前的碳源。畢赤酵母中的醇氧化酶基因（如 AOX1）在甲醇存在下被激活，從而驅(qū)動(dòng)外源基因的高效表達(dá)。該階段的條件控制對(duì)于外源蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要影響，需要嚴(yán)格控制甲醇的添加量、添加速率以及發(fā)酵環(huán)境的溫度、pH 值和溶氧量等參數(shù)，以確保外源基因能夠持續(xù)、高效地表達(dá)，同時(shí)避免甲醇對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性以及其他不利影響。

2、發(fā)酵培養(yǎng)基的種類(lèi)和配方

畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基的種類(lèi)多樣，不同的培養(yǎng)基配方適用于不同的發(fā)酵階段和目的。

BSM（基礎(chǔ)鹽）培養(yǎng)基是畢赤酵母發(fā)酵常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之一，其典型配方為：85％磷酸 26.7ml/l，二水硫酸鈣 0.93g/l，硫酸鉀 18.2g/l，七水硫酸鎂 14.9g/l，氫氧化鉀 4.13g/l，甘油 40.0g/l，PTM1 4.35ml/l。這種培養(yǎng)基能夠?yàn)楫叧嘟湍傅纳L(zhǎng)提供基本的營(yíng)養(yǎng)成分，包括氮源、磷源、鉀源、鎂源等無(wú)機(jī)鹽以及甘油作為碳源，PTM1 則補(bǔ)充了酵母生長(zhǎng)所需的微量元素和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有助于維持酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。

F22 培養(yǎng)基也是一種常見(jiàn)的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方在不同的研究和生產(chǎn)應(yīng)用中可能會(huì)有所調(diào)整，但一般包含適量的碳源（如葡萄糖或甘油）、氮源（如酵母提取物、蛋白胨等）、無(wú)機(jī)鹽（如硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀等）以及其他添加劑（如生物素、微量元素溶液等）。與 BSM 培養(yǎng)基相比，F(xiàn)22 培養(yǎng)基在營(yíng)養(yǎng)成分的組成和比例上可能有所優(yōu)化，以滿(mǎn)足特定的發(fā)酵需求，例如在某些情況下可能更有利于提高外源蛋白的表達(dá)量或改善蛋白的質(zhì)量。

除了上述兩種常見(jiàn)的培養(yǎng)基外，還有許多其他的畢赤酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基的配方往往是根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、菌株特性以及發(fā)酵工藝的要求進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整的。例如，在一些研究中，為了提高畢赤酵母對(duì)特定底物的利用效率或增強(qiáng)其對(duì)環(huán)境壓力的耐受性，會(huì)在培養(yǎng)基中添加一些特殊的成分，如氨基酸、有機(jī)酸、多糖等；或者通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的比例，來(lái)優(yōu)化酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝途徑，從而實(shí)現(xiàn)更高的發(fā)酵效率和產(chǎn)物產(chǎn)量。

3、發(fā)酵工藝參數(shù)

在畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中，工藝參數(shù)的精確控制對(duì)于發(fā)酵的成功與否起著至關(guān)重要的作用，這些參數(shù)包括 pH、溫度、溶氧等，它們相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同決定了畢赤酵母的生長(zhǎng)狀況、代謝活性以及外源蛋白的表達(dá)水平。

pH值：是影響畢赤酵母發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一。畢赤酵母在不同的生長(zhǎng)階段和代謝過(guò)程中，對(duì) pH 值的要求有所不同。在細(xì)胞生長(zhǎng)階段，一般適宜的 pH范圍為 5.0 - 6.0，在此 pH 條件下，酵母細(xì)胞能夠保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，酶的活性也能得到較好的發(fā)揮，有利于細(xì)胞的增殖和代謝產(chǎn)物的積累。pH值在畢赤酵母的發(fā)酵過(guò)程中，不僅會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，而且對(duì)外源蛋白的表達(dá)也會(huì)產(chǎn)生重要影響。pH值對(duì)畢赤酵母的影響主要包括以下方面：（1)影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞的新陳代謝，從而使外源蛋白的表達(dá)也受到影響；(2)影響細(xì)胞膜的通透性，對(duì)細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和排出代謝產(chǎn)物時(shí)產(chǎn)生一定的影響；（3)pH值會(huì)對(duì)培養(yǎng)基中成分和細(xì)胞的代謝產(chǎn)物的離解產(chǎn)生影響，從而對(duì)細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)造成影響；（4)pH值也可能對(duì)細(xì)胞的代謝過(guò)程產(chǎn)生影響，使細(xì)胞代謝產(chǎn)物的含量發(fā)生改變另外，在高密度發(fā)酵過(guò)程中，為了減少外源蛋白被蛋白酶降解，應(yīng)避開(kāi)蛋白酶作用的最適pH值，將pH 值設(shè)定在偏離外源蛋白等電點(diǎn)處，也會(huì)提高外源蛋白的收獲率。

溫度：對(duì)畢赤酵母的生長(zhǎng)和代謝也具有顯著影響。畢赤酵母的生長(zhǎng)溫度一般在 28 - 30℃之間較為適宜。在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較快，代謝活動(dòng)旺盛，能夠高效地利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖。然而，如果溫度過(guò)高，超過(guò) 32℃，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因?yàn)楦邷貢?huì)破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的穩(wěn)定性，從而影響細(xì)胞的正常生理功能。相反，在較低的溫度下，雖然細(xì)胞的生長(zhǎng)速度會(huì)減慢，但一些研究表明，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度可以改善靶蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。這是因?yàn)榈蜏乜梢越档图?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊的應(yīng)力，減少錯(cuò)誤折疊的發(fā)生，同時(shí)也能減少蛋白酶的活性，降低外源蛋白的水解程度，從而有利于外源蛋白的正確折疊和積累。

溶氧（DO）：是畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中另一個(gè)關(guān)鍵的工藝參數(shù)。畢赤酵母在利用甘油和甲醇進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝時(shí)都需要氧氣的參與，因此維持合適的溶氧水平對(duì)于確保發(fā)酵的順利進(jìn)行至關(guān)重要。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，通常需要將溶氧濃度維持在＞20% 的水平。在細(xì)胞生長(zhǎng)初期，由于菌體數(shù)量較少，對(duì)氧氣的需求相對(duì)較低，此時(shí)通過(guò)適當(dāng)?shù)耐夂蛿嚢杓纯蓾M(mǎn)足細(xì)胞的溶氧需求。隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)的增強(qiáng)，對(duì)氧氣的消耗逐漸增加，此時(shí)需要進(jìn)一步調(diào)整通氣量、攪拌速度或采用純氧補(bǔ)充等方式來(lái)提高溶氧水平，以保證細(xì)胞能夠獲得足夠的氧氣進(jìn)行代謝。如果溶氧不足，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、代謝產(chǎn)物積累減少，甚至?xí)鸺?xì)胞死亡，從而嚴(yán)重影響發(fā)酵的效率和產(chǎn)物的產(chǎn)量。

培養(yǎng)時(shí)間：是在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得最高蛋白表達(dá)水平的最關(guān)鍵因素之一，在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，生產(chǎn)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)（約100h）。培養(yǎng)時(shí)間與酵母細(xì)胞的數(shù)量和目標(biāo)蛋白的降解程度有關(guān)，有研究表明，巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的最高生長(zhǎng)密度是培養(yǎng)96h，而最高蛋白表達(dá)發(fā)生在48h［11]，這表明較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間很可能會(huì)導(dǎo)致所表達(dá)蛋白被水解消化，也有其他的研究表明最佳蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)間發(fā)生在培養(yǎng)72~96 h[2

畢赤酵母發(fā)酵工藝是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，需要對(duì)發(fā)酵階段、培養(yǎng)基配方和工藝參數(shù)進(jìn)行精確的控制和優(yōu)化，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）方法，系統(tǒng)地優(yōu)化發(fā)酵條件，如pH、溫度、溶氧和培養(yǎng)基組成以充分發(fā)揮畢赤酵母的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效表達(dá)和生產(chǎn)。通過(guò)深入了解畢赤酵母的發(fā)酵特性和需求，結(jié)合先進(jìn)的發(fā)酵技術(shù)和設(shè)備，不斷優(yōu)化發(fā)酵工藝，有望進(jìn)一步提高畢赤酵母發(fā)酵的效率和產(chǎn)物質(zhì)量。

四、畢赤酵母與發(fā)酵罐的 “默契配合”

在畢赤酵母的發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵罐作為核心設(shè)備，為畢赤酵母的生長(zhǎng)和代謝提供了關(guān)鍵的環(huán)境條件，確保其能夠高效表達(dá)外源蛋白。

發(fā)酵罐通過(guò)精確的溫度控制系統(tǒng)，為畢赤酵母提供適宜的生長(zhǎng)溫度。如前所述，畢赤酵母在 28 - 30℃的生長(zhǎng)階段以及在誘導(dǎo)表達(dá)階段對(duì)溫度的特定要求，發(fā)酵罐的溫控系統(tǒng)能夠精準(zhǔn)地維持在這些設(shè)定溫度范圍內(nèi)，避免溫度過(guò)高或過(guò)低對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的不利影響。在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中，這種精確的溫度控制尤為重要，它保證了每一批次的畢赤酵母都能在穩(wěn)定且適宜的溫度環(huán)境下生長(zhǎng)，從而提高了生產(chǎn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

對(duì)于 pH 值的調(diào)控，發(fā)酵罐配備了先進(jìn)的 pH 檢測(cè)和調(diào)節(jié)裝置。在畢赤酵母發(fā)酵的不同階段，根據(jù)其對(duì) pH 值的需求變化，發(fā)酵罐能夠自動(dòng)添加酸堿溶液，將 pH 值精確維持在所需范圍內(nèi)。在細(xì)胞生長(zhǎng)階段保持 pH 5.0 - 6.0，誘導(dǎo)表達(dá)階段調(diào)整到 3.0 - 5.0，這種精準(zhǔn)的 pH 控制有助于維持酵母細(xì)胞內(nèi)酶的活性，促進(jìn)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝，同時(shí)減少外源蛋白的降解，提高蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量。

溶氧水平的控制也是發(fā)酵罐的關(guān)鍵功能之一。畢赤酵母在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)溶氧需求較高，發(fā)酵罐通過(guò)合理的通氣系統(tǒng)和攪拌裝置，確保溶氧濃度始終維持在＞20% 的水平。通氣系統(tǒng)能夠向發(fā)酵液中均勻地通入空氣或氧氣，而攪拌裝置則通過(guò)不斷攪拌，使氧氣在發(fā)酵液中充分分散，提高氧氣的傳遞效率，滿(mǎn)足畢赤酵母在不同生長(zhǎng)階段對(duì)氧氣的需求，保證其代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行，進(jìn)而促進(jìn)外源蛋白的高效表達(dá)。

攪拌和通氣系統(tǒng)的協(xié)同作用還能保證發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均勻分布，避免出現(xiàn)局部營(yíng)養(yǎng)缺乏或過(guò)剩的情況，使每一個(gè)畢赤酵母細(xì)胞都能在良好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)。同時(shí)，發(fā)酵罐的密封性能也十分重要，它能夠防止外界雜菌的污染，確保畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程的純凈性和穩(wěn)定性，避免因染菌而導(dǎo)致的發(fā)酵失敗或產(chǎn)物質(zhì)量下降等問(wèn)題。

錦維生工的發(fā)酵罐產(chǎn)品正是基于這些關(guān)鍵需求進(jìn)行設(shè)計(jì)和制造的，擁有先進(jìn)的溫度控制、pH 調(diào)節(jié)、溶氧控制以及高效的攪拌和通氣系統(tǒng)，能夠?yàn)楫叧嘟湍傅陌l(fā)酵提供優(yōu)化的環(huán)境條件，幫助用戶(hù)實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)，無(wú)論是在實(shí)驗(yàn)室小試階段還是工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中，都能發(fā)揮出的性能，滿(mǎn)足不同用戶(hù)對(duì)畢赤酵母發(fā)酵的各種需求，助力生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展。我們將持續(xù)關(guān)注畢赤酵母的研究動(dòng)態(tài)和應(yīng)用需求，不斷優(yōu)化和創(chuàng)新發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)與制造技術(shù)，提升發(fā)酵罐的性能和穩(wěn)定性，為畢赤酵母的發(fā)酵生產(chǎn)提供更加先進(jìn)、高效的設(shè)備支持，共同推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)邁向更加輝煌的未來(lái)。

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